摘要
芽孢杆菌属的成员广泛分布于自然环境中，数十年来，人们对其生理特性、遗传学特征、生态功能及应用价值进行了深入研究。然而，尽管该菌属在自然界中普遍存在，但由于其分类体系复杂且不断演变，芽孢杆菌的特征描述与分类仍面临挑战。本文综述了当前芽孢杆菌分类学研究现状，并总结了该属系统发育研究的关键进展。基于对芽孢杆菌系统发育的清晰认知，我们系统梳理了鉴定与定量分析该菌属的方法论，同时探讨了各方法的优缺点。
作者简介
Xinming Xu（https://www.universiteitleiden.nl/en/staffmembers/xinming-xu/）
热情专注的微生物学家，专攻生物信息学领域。毕业于丹麦技术大学并获得博士学位，主要研究芽孢杆菌及相关土壤微生物的定量生态学。目前，博士后研究项目融合实验与计算方法，致力于构建促进植物生长的合成微生物群落。
Akos Kovács（https://www.universiteitleiden.nl/en/staffmembers/akos-kovacs）
Kovács 实验室专注于运用分子生物学与生态进化方法相结合的研究策略，探究芽孢杆菌在生物膜形成过程中的生长发育及其与根际微生物的相互作用。通过整合基因组测序、基因工程、转录组学和天然产物化学等技术，揭示枯草芽孢杆菌对其生物环境的响应机制，旨在预测这种植物根际促生菌的生防效能。
介绍
芽孢杆菌属包含多种物种，其显著特征在于能够形成休眠的内生孢子，这些孢子能在辐射、干旱或高温等恶劣条件下存活。微生物学家不断在多种自然环境中发现芽孢杆菌及相关物种，如土壤、空气和海洋沉积物，以及人造环境如航天器洁净室或医院。该属成员参与众多生态系统功能，反映出其分布环境的多样性（Saxena等，2020）。
尽管芽孢杆菌的初步鉴定始于约150年前，但其分类学界定至今仍存在显著混乱（Zeigler & Perkins，2021）。原因之一是过去采用的标准宽松，仅凭需氧形成孢子的能力就将多种细菌归入该属。芽孢杆菌系统发育的研究历程深刻反映了细菌鉴定方法的持续进步。分子遗传学的快速发展在短期内催生了大量新物种的涌现，一方面拓展了我们对芽孢杆菌属多样性、分布及功能的认识，但另一方面也导致该属成为包含数百个分类单元的复杂群体，这些类群虽共享属名，却缺乏明确共有的独特性状。精准界定芽孢杆菌属成员有助于推断物种间的进化关联与遗传多样性，而系统发育分析可辅助物种划分和新菌株鉴定，使属内特征描述与系统发育研究形成相互印证、互为补充的关系。
本文首先通过总结关键时间节点上新物种的出现、成员重新分类与描述，系统梳理芽孢杆菌属的分类学发展历程。对芽孢杆菌系统发育框架的全面理解是实现物种精准鉴定的基石。继而，我们概述了应用于芽孢杆菌属物种鉴定与定量的方法论，重点关注其进展与局限。通过整合分子技术现状，我们旨在为优化和推进芽孢杆菌的鉴定与定量研究提供建议。
对芽孢杆菌系统发育历程的回溯性考察
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）是科恩与科赫于19世纪70年代末期最早描述的芽孢杆菌属物种。科恩首次对枯草芽孢杆菌进行了详细描述，特别关注了内生孢子的形成、萌发和耐热性（Cohn, 1876）。而炭疽芽孢杆菌的最初鉴定则完全依赖于对疑似培养物进行系列动物接种后观察炭疽病发展的方法（Irenge & Gala, 2012）。当时，无法在实验动物中引发炭疽病的分离株被简单归类为蜡样芽孢杆菌（B. cereus）或类炭疽芽孢杆菌（B. anthracis similis）。
此后50年间，许多呈杆状、革兰氏阳性、能形成孢子且需氧的细菌被归入芽孢杆菌属或芽孢杆菌科。然而，这种模糊的定义难以适配芽孢杆菌这样一个缺乏专属表型特征的多样化属。例如，部分芽孢杆菌分离株会表现出革兰氏染色可变性（Burke & McDonald, 1983）；某些物种在特定生长阶段或营养缺乏条件下会呈现圆形或球状（Gray et al., 2019）；该属还同时包含需氧、厌氧和兼性厌氧物种（Clements et al., 2002）。这种粗放的分类标准导致芽孢杆菌物种存在严重的多系性和异质性。近十年来，为深入理解芽孢杆菌属的系统发育与演化历史，部分物种被重新划分至其他属，剩余物种修订了描述，且这些属的新物种设立了新标准（Carroll et al., 2020）。
Gupta等学者对300多个芽孢杆菌/芽孢杆菌科基因组进行的比较基因组系统发育分析是芽孢杆菌系统学发展的重要里程碑。他们首次识别出芽孢杆菌的6个新分支，并将这些分支中的物种转移至新属，包括近芽孢杆菌属（Peribacillus gen. nov.）、泡状芽孢杆菌属（Cytobacillus gen. nov.）、属间芽孢杆菌属（Mesobacillus gen. nov.）等。此外，他们提出芽孢杆菌属应仅限定于“枯草芽孢杆菌分支”和“蜡样芽孢杆菌分支”，并证实这两个分支外的物种明确形成了17个独立分支，将其重新分类为新属（Patel & Gupta, 2020）。最终，291个已知芽孢杆菌物种中的206个被重新划分至其他属，仅余27个和19个物种分别归属于枯草芽孢杆菌分支和蜡样芽孢杆菌分支。“枯草芽孢杆菌分支”包含模式物种枯草芽孢杆菌，代表严格意义上的芽孢杆菌属；“蜡样芽孢杆菌分支”则涵盖炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌等人类致病菌。他们还提议，所有芽孢杆菌属新物种需满足最低标准：属于这两个分支的候选物种应通过16S序列系统发育树或串联蛋白序列数据支持。
基于当前芽孢杆菌分类体系，我们通过分别梳理“枯草芽孢杆菌分支”与“蜡样芽孢杆菌分支”来概述芽孢杆菌分类学的主要变革。希望通过历史视角回溯芽孢杆菌属的系统发育历程，能为其复杂分类体系提供更清晰的认知框架，并为物种表征奠定基础。
枯草芽孢杆菌类群
枯草芽孢杆菌类群的物种在遗传上密切相关，且表型特征难以区分。这类微生物的营养细胞大多小于1微米，通常为中温中性菌，但部分菌株能够耐受高pH环境。该类群被公认为高效次级代谢产物生产者，其基因组中至少有4%–5%的序列致力于次级代谢产物合成。在枯草芽孢杆菌类群产生的多种次级代谢产物中，丰原素（fengycin）和表面活性素（surfactin）等化合物具有广谱生物防治功能，包括抗真菌、抗细菌以及诱导植物系统抗性等特性。因此，市售生物肥料和生物杀菌剂多源自该类群（Dunlap，2019b；Pérez-García等，2011）。
该群最初提出的物种——枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），早在50多年前已被描述。随着新物种的涌入和原有物种的重新分类，枯草芽孢杆菌类群的系统基因组学经历了多次调整（图1）。多项研究提供了可靠的系统发育术语和分子标记，使得多个进化支得以重新界定。例如吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）和克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）被划归其他属，分别更名为Alkalicoccobacillus gibsonii和Shouchella clausii。同时，诸如空气芽孢杆菌（Bacillus aerius）、嗜气芽孢杆菌（Bacillus aerophilus）和平流层芽孢杆菌（Bacillus stratosphericus）等已无法从菌种库获取的物种，被建议列为废弃名称。该类群中尚有部分物种未被《国际原核生物命名法规》（ICNP）正式收录，例如应用于纳豆发酵生产近100年的纳豆芽孢杆菌（B. subtilis subsp. natto）。芽孢杆菌属内某些亚种的分类基于独特的遗传特征或对不同生境的适应性，但枯草芽孢杆菌水源亚种（B. subtilis subsp. inaquosorum）和斯皮兹泽尼氏亚种（B. subtilis subsp. spizizenii）因缺乏显著表型差异长期维持亚种地位，近期通过基因组比对及表型化学分类学鉴定已被提升为物种级别。
贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）的分类存在争议，最初被提议作为解淀粉芽孢杆菌的异名，但基于比较基因组学和DNA-DNA相关性计算被推翻。此外，植物相关菌株解淀粉芽孢杆菌植物亚种（B. amyloliquefaciens subsp. plantarum） FZB42T是否应作为贝莱斯芽孢杆菌的异名也存在争论。Dunlap等（2015）和Fan等（2017）证实这两个类群在形态、生理、化学分类和系统发育特征上仅存在微小差异，表明FZB42应归属于贝莱斯芽孢杆菌。
目前，由于复杂的分类学（重新）划分，枯草芽孢杆菌类群中用作植物病原菌拮抗菌的大多数商业化登记物种存在命名不一致问题（13？？？）。例如贝莱斯芽孢杆菌是最常被误鉴定的菌株，常被登记为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。这提示我们需要建立严格的新物种判定标准，构建统一的枯草芽孢杆菌类群系统发育框架，以促进相关研究和应用。
蜡样芽孢杆菌群
蜡样芽孢杆菌群（广义的蜡样芽孢杆菌）是芽孢杆菌属中另一个重要类群，在农业、人类健康、食品腐败和环境领域具有重要作用。该群包含多种致病菌株：炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）是炭疽病的病原体（Koch, 1876）；蜡样芽孢杆菌（B. cereus）是引起呕吐型和腹泻型食源性疾病的病原体（Jovanovic等, 2021）；苏云金芽孢杆菌（Bacillus. thuringiensis）作为生物防治剂应用于无脊椎动物病原体（Brar等, 2006）。该群的致病性主要与其携带的质粒相关：炭疽芽孢杆菌含有pXO1和pXO2质粒，分别编码炭疽毒素组分和宿主免疫逃避所必需的荚膜生物合成操纵子；呕吐型蜡样芽孢杆菌菌株携带编码毒素cereulide生物合成基因簇的pCER270质粒；苏云金芽孢杆菌含有编码晶体蛋白的质粒。质粒易丢失或转移的特性使其成为这些菌种表型划分的简单但不完全可靠的标志物。
该群的分类学发展历经数十年争议（图2）。Smith和Gordon将高度相关菌种归为“合并派（lumpers）”而非“拆分派（splitters）”，并预见随着分型技术的进步，“合并派”终将解构为“标准菌种”。果然，曾作为蜡样芽孢杆菌“母种”变种的炭疽芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides），于1980年以更清晰描述被列入《细菌名称核准名录》。此后数十年间该群鲜有新种加入，直至2013年东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）和细胞毒素芽孢杆菌（Bacillus cytotoxicus）作为新种被纳入，标志着首次采用全基因组测序数据描述未知菌种的研究。2017年又有9个新种的提议有效扩充了该群，但由于采用不同的基因组种阈值进行物种划分，这些新种的界定是否导致分类模糊性仍存疑。
多项研究致力于规范新种鉴定并建立分类框架。Carroll等（2020）提出命名框架，重新划分群内菌种并将医学重要菌种归入亚谱系，如将呕吐型蜡样芽孢杆菌称为B. mosaicus subsp. cereus，但该命名体系迄今未获广泛采纳。尽管蜡样芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌在系统发育上与枯草芽孢杆菌支系无关，但因学界出版物和日常使用中术语根深蒂固，加之这些菌种的高致病特性，仍需将其保留于芽孢杆菌属。根据命名法规第56a条，不建议转移该群菌种，且任何命名框架都需经过严格验证以避免混淆。
芽孢杆菌的鉴定与定量分析
从革兰氏染色到16S rRNA测序，科学家们为精确描述细菌特征的不懈努力已在医疗健康、农业、生物技术等领域产生深远影响。对于致病性芽孢杆菌而言，快速且高分辨率的鉴定对指导医疗方案选择和治疗时长至关重要。作为农业基础，精准鉴定芽孢杆菌种属具有重大意义，有助于甄别其田间应用潜力。此外，芽孢杆菌在硝化作用、土壤有机质降解和溶磷等生态系统功能中的多维度参与，要求通过种属鉴定来理解其在自然环境中的生态角色。总体而言，芽孢杆菌的鉴定与表征在众多领域具有深远意义。因此，科学家已开发出从传统表型鉴定到分子分析的一系列方法。下文将系统评述芽孢杆菌鉴定与表征方法及其优缺点。
前NGS时代的芽孢杆菌鉴定：生理与形态学测试
二代测序（NGS）的出现实现了不依赖培养、大规模、高效率的单菌株及复杂菌群分析。因此，包括生化与生理测试在内的传统方法在界定细菌种属时似乎已失去重要性。然而对于某些医学重要菌种，显微镜观察或生化测试仍可能比16S rRNA基因测序更快捷，有助于临床快速诊断。
枯草芽孢杆菌群的生理分化测试使用频率较低，主要因其形态会随环境条件变化，导致固体培养基上菌落形态多样（Tasaki等，2017）。但仍有特定生理测试用于区分该群菌种：短小芽孢杆菌以淀粉水解阴性和马尿酸阳性为特征；地衣芽孢杆菌可通过兼性厌氧、丙酸盐阳性和55°C高温生长与短小芽孢杆菌区分；在酪氨酸培养基上培养时，深褐芽孢杆菌（B. atrophaeus）和枯草芽孢杆菌可凭色素形成差异鉴别。此外，枯草芽孢杆菌较解淀粉芽孢杆菌能更快利用乳糖产酸且葡萄糖酸盐利用速率较慢。但需注意该类形态学方法的局限性，分子鉴定与不断演化的分类学揭示了其不准确性。
表型特征仍是蜡样芽孢杆菌复合群初步分类的主要手段。例如炭疽芽孢杆菌无溶血性、无运动性、对γ噬菌体敏感且不分解酪氨酸；蕈状芽孢杆菌和假蕈状芽孢杆菌（Bacillus pseudomycoides）在琼脂培养基上形成根状菌落（间下图，Logan & De Vos, 2015）；苏云金芽孢杆菌在稳定期形成可通过显微镜观测的晶体；蜡样芽孢杆菌在甘露醇-卵黄-多粘菌素琼脂培养基上产生卵磷脂酶且不发酵甘露醇（Baldwin, 2020; Schnepf等，1998）。致病性与无害蜡样芽孢杆菌菌株的表型分析仍具挑战，但上述测试足以将蜡样芽孢杆菌与该群其他成员区分（Kamar等，2013）。
传统DNA测序技术
在靶向序列分型方案实施之前，限制性片段长度多态性、脉冲场凝胶电泳、随机扩增多态性DNA、多位点可变数目串联重复以及多位点酶电泳等方法在芽孢杆菌属成员的区分中起着关键作用。随后，单一位点与多位点序列分型方法（SLST和MLST）成为并持续作为鉴定芽孢杆菌物种或亚种的重要工具。
在分子遗传学的蓬勃发展时期，16S rRNA基因作为细菌分类的SLST支柱，使得大规模系统发育重建成为可能。然而，其对所有芽孢杆菌物种的区分能力有限。研究表明，93.93%的芽孢杆菌属成员携带多个16S rRNA基因拷贝，且55.32%的16S等位基因与其他物种完全相同（Mikael Lenz Strube）。因此，研究人员提出以rpoB、gyrA和gyrB等蛋白编码基因作为鉴定芽孢杆菌物种的潜在生物标志物。Dunlap（2019a）建议使用gyrA或gyrB进行枯草芽孢杆菌群的初步划分，而pyrA用于蜡样芽孢杆菌群的区分。近期我们系统分析了文献常用引物组，发现基于gyrA和rpoB的引物在枯草芽孢杆菌群内具有高种内特异性。出乎意料的是，基于gyrB的简并引物对某些芽孢杆菌基因组无扩增效果，这引发了对gyrB系统发育区分能力的质疑。同时，我们证实延伸因子热不稳定蛋白TU（tuf）是优良的系统发育标记，不仅对芽孢杆菌属具有特异性，还能有效区分该属内已描述的所有物种。这些高度保守的蛋白编码基因为尚未获得完整基因组的芽孢杆菌属分离株在种或亚种水平提供了初步鉴定依据。
除SLST外，多种方法曾被用于芽孢杆菌物种或亚种的鉴别，其中不少在不同时期被视为“金标准”。利用基因组中分散分布的多管家基因串联组合的MLST技术，是区分近缘物种最有效的工具之一。该方法已广泛应用于蜡样芽孢杆菌群的进化史和群体遗传学研究，同时也针对枯草芽孢杆菌群开发了特定方案。尽管MLST具有结果明确、可重复性强、实验室间易移植等优势，但芽孢杆菌鉴别的主要需求已从属/种水平转向菌株水平，而MLST在菌株层面难以实现清晰区分。然而，新一代测序技术的发展革新了菌株分型标准，实现了菌株水平鉴别。如下节所述，NGS为研究芽孢杆菌群体及其多样生态角色开辟了新途径。
NGS时代重塑芽孢杆菌鉴定
新一代测序技术的进步推动了微生物组研究的快速发展。作为最常应用的NGS方法之一，全基因组测序促进了新型芽孢杆菌物种发现的爆发式增长，并提供了海量基因组序列。全基因组测序的应用突破了传统方法的低分辨率局限，重新厘清了芽孢杆菌物种的进化关系。截至本文撰写时，美国国家生物技术信息中心已收录逾千个完整芽孢杆菌基因组，且数量持续增长。为系统表征新型芽孢杆菌分离株，学界建议在任何情况下都应采用超越全基因组测序的多相分析方法。理想情况下，生化鉴定、表型分析、基因分型检测，结合全长16S rRNA基因分析和全基因组测序后的比较基因组分析，应共同为芽孢杆菌表征提供全面信息。
基于NGS探索群落环境中的芽孢杆菌多样性
当前学界普遍认识到微生物并非孤立存在，而是错综复杂地交织在微生物网络中。因此研究重点已从单一培养转向能更准确反映微生物组自然生存方式的复杂群落。
基于DNA的高通量测序技术（如扩增子测序和宏基因组测序）的革命性进展，彻底改变了我们研究自然微生物群落组成和功能的能力。其中16S rRNA基因扩增子测序因其成本效益高、速度快的特点，已成为细菌群落组成分析的常规方法。但如前所述，16S rRNA基因在芽孢杆菌属中存在极高的等位基因多样性及广泛的物种间序列重叠，导致这些基因组获得的扩增子很少具有物种特异性。例如，针对V3V4高变区的常用16S扩增子引物在芽孢杆菌属中显示63.90%的等位基因多样性和74.47%的物种重叠率（Strube，2021）。因此当使用V3V4宏分类学分析含有枯草芽孢杆菌的群落时，会因该物种存在多重等位基因而错误定义多个独特的扩增子序列变体，导致样本丰富度高估。更甚者，在含有苏云金芽孢杆菌的样本中，可能错误推断出多达14个其他物种的存在，因为这些物种均共享相同的V3V4等位基因。
扩增子测序的另一种表述是标记基因测序，其通过靶向特定基因区域来解析微生物系统发育。为提高芽孢杆菌属检测特异性，多项研究采用具有高分辨率的保守基因（如SLST方案中的基因），开发了基于扩增子的芽孢杆菌群落分析方法。Porcellato等（2019）从MLST方案中筛选出蜡样芽孢杆菌群组中分辨力最强的三个基因，证明panC基因的分辨能力优于glpT和pycA。他们发现嗜冷芽孢杆菌（包括韦氏芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌）是牛奶样本中最主要的系统发育群。此外，管家基因gyrA（编码DNA旋转酶A亚基）也被用作评估芽孢杆菌物种多样性的分子标记。该基因在模拟群落中能检测至少92种芽孢杆菌并对8个菌株中的6个实现分型，但尚未在环境样本中验证。
上述两种方法在芽孢杆菌物种检测范围上存在局限：基于panC的扩增子测序特异性针对蜡样芽孢杆菌群组，而基于gyrA的方法主要关注枯草芽孢杆菌群组。寻找兼具高变区（用于种/亚种鉴定）和侧翼保守区（用于引物结合）的通用芽孢杆菌标记基因颇具挑战。近期开发的tuf基因靶向扩增子测序方法实现了迄今最高的芽孢杆菌物种覆盖度与特异性，能精准解析自然土壤群落中的芽孢杆菌物种组成，并具潜力用于追踪芽孢杆菌接种剂的田间存续情况（了解更多：基于tuf的扩增子测序方法揭示芽孢杆菌分类特异性）。
宏基因组学在物种/菌株水平解析微生物群落结构、功能基因、代谢通路等方面具有不可替代的作用。例如，Kröber等（2014）应用宏基因组测序追踪解淀粉芽孢杆菌接种剂在田间的存续，并分析了接种剂产生的次生代谢物对根际土著群落的影响。Huang等（2022）则通过宏基因组学探究了枯草芽孢杆菌H11亚种对陈化烤烟微生物群落结构及代谢潜能的影响。此外，宏基因组学还被用于分析自然发酵豆制品中的芽孢杆菌噬菌体丰度，凸显了其在解析病毒-细菌互作方面的潜力。
毫无疑问，NGS技术能更深入地揭示芽孢杆菌属在自然环境中的作用。然而该方法仅能半定量评估芽孢杆菌丰度，因其测量的是微生物的相对丰度而非绝对丰度。近期研究将流式细胞术（FCM）和qPCR等分子方法与NGS数据结合以估算绝对微生物丰度，但这些定量方法能在多大程度消除扩增子测序偏差尚不明确。因此本文最后将专门评述针对芽孢杆菌的定量研究方法，这亦是该领域的重要研究方向。
强调定量分析：芽孢杆菌属研究中超越鉴定的关键作用
在某些情况下，量化细菌丰度比单纯检测或鉴定更为关键。作为应用最广泛的细菌属之一，芽孢杆菌衍生的商业产品涵盖生物肥料、生物杀菌剂、生物农药，以及益生菌、酶制剂和维生素等多个领域。要解决这些产品在功效、安全性和一致性方面的关键问题，定量数据不可或缺：田间施用的生防剂是否有效促进植物生长？益生菌是否含有足量菌株能持续有效地惠及宿主？生物农药在食物链中的残留水平如何？本文重点探讨利用定量数据解决这些实际挑战的研究。
依赖固体培养基菌落计数的传统培养方法通常会低估总丰度。而定量实时荧光PCR和荧光原位杂交等非培养方法，通过细菌细胞DNA进行种群定量，无需繁琐的菌落计数。这些基于DNA的技术已成功应用于芽孢杆菌的定量分析，为工业应用提供了不可替代的信息。
谢等人开发了针对枯草芽孢杆菌群的快速定量检测引物/探针组，成功追踪了接种剂在拟南芥根际的定殖动态。该方法对农业领域意义重大，特别是在多菌株作为生防剂抑制病原体时，qPCR技术可定量监测生防剂随环境变化的种群动态，助力田间试验筛选“优势菌株”。在食品工业中，芽孢杆菌因其腐败性和致病性不受欢迎，qPCR技术能定量检测食源性病原体，保障行业卫生标准。
PCR类方法的局限在于会因扩增死细胞而高估活菌数。该问题可通过叠氮溴化丙锭处理得以解决，这种核酸嵌入染料能抑制死细胞DNA扩增。值得注意的是，PMA-qPCR不仅能计数营养细胞，还可检测芽孢杆菌的活化孢子，这对产孢菌株尤为重要。
qPCR的另一局限是无法揭示细菌与环境互作。FISH技术通过荧光标记探针与完整细胞内特定序列杂交，实现自然环境微生物的可视化鉴定。Posada团队针对促进植物生长的枯草芽孢杆菌EA-CB0575设计特异性探针，成功实现同种多菌株杂交且不与近缘种交叉反应。为克服原生菌自发荧光和根部结构干扰，他们进一步开发了催化报告沉积法FISH技术（CARD-FISH），两种方法均能有效检测不同栽培系统植物根部的枯草芽孢杆菌。Pasulka团队还利用FISH探针定量检测直接饲喂微生物产品和作物微生物生物刺激素中的芽孢杆菌丰度，确保益生菌含量达标。目前FISH技术在产品菌株计数方面的潜力尚待挖掘，我们相信随着技术发展，该技术将更广泛应用于芽孢杆菌施用后生态影响研究。
流式细胞术等其他非培养技术可快速测定细胞数量、尺寸相关散射信号和荧光强度，为沉积物、水体、土壤等复杂环境研究提供与传统方法互补的新视角。该技术能有效分离食品基质中的蜡样芽孢杆菌营养体或芽孢，并进行特异性荧光标记。Majeed研究展示了利用FCM定量商业胶囊和片剂中凝结芽孢杆菌复苏阶段的应用，这种能定量”活的非可培养”状态菌群的技术尤为珍贵，因为传统培养法会低估此类菌群规模。表1讨论了各定量技术的优势与局限，旨在为研究者提供全面参考。
结论
Smith与Gordon在其研究中强调：“当某个类群仅有少量菌株可用时（这种情况经常发生），其物种描述必须保持暂定性，直至通过更多菌株的研究得以验证”。随着测序技术成本下降和不断进步，微生物学家将继续探索不同生境中的芽孢杆菌。这必将扩展现有基因组数据库，使新物种的描述更加全面。然而在这些进展中，研究者需审慎对待新物种的提案和分离株的分类。我们不应仅依赖单一技术表征新分离株，而应采用多维方法。组学数据（包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学）的整合将持续重塑当代芽孢杆菌分类学，为其功能特性、进化历史、特征及其在自然界中的生态作用提供宝贵见解。
当前，芽孢杆菌属的鉴定正朝着高精度、高通量、高速度的方向以前所未有的规模转变。此外，物种鉴定焦点呈现双向发展趋势：一方面进行精细的分子分析，深入至菌株乃至克隆水平；另一方面上升至群落层面，研究其在自然生境（如土壤）中的生存方式。尽管严格来说细菌鉴定依赖于所用参考数据库，但这类分类归属可随动态变化的分类学格局而调整。因此，只有通过分类学家与微生物学家的持续协作，才能构建完善的基因组参考数据库和高精度鉴定系统。
尽管芽孢杆菌属在医药、农业和工业领域应用广泛，但对复杂群落中芽孢杆菌数量的量化研究仍显不足。原因之一在于缺乏合适的种群测定方法，以及针对多样环境选择适用技术方案存在挑战。基于本文综述的研究，应对这些实际挑战需要开发能原位量化芽孢杆菌群落成员的专属工具。结合多功能组学方法，对其功能与代谢的研究将推动我们对芽孢杆菌生态学的理解迈上新台阶。