标题：根系分泌物类型决定根际微生物菌群结构和抑病功能
单位：南京农业大学，有机固体废物利用江苏省重点实验室
日期：2020年7月7日
摘要
背景：植物来源的低分子量化合物在塑造土壤微生物群功能中起着至关重要的作用。虽然各种化合物已被证明对土壤微生物有影响，但大多数数据都是针对具体情况的，并不能提供对其影响的一般预测。
结论：本研究表明，植物根系分泌的低分子量化合物(糖、氨基酸、有机酸和酚酸)的化学结构关系可以预测地影响微生物组的多样性、组成和功能，从而抑制植物病害。
方法：用单一或混合的代表性化合物来改良土壤，模拟植物的碳沉积。然后评估了不同类别的化合物或它们的组合如何影响微生物组的组成和番茄植株免受土壤传播的番茄枯萎病细菌病原体的保护。
结果：化合物类别能很好地预测微生物组组成和多样性的变化。与糖和酚酸相比，有机酸和氨基酸通常会降低微生物组的多样性。这些变化还与疾病发病率有关，氨基酸和含氮化合物混合物引起更严重的疾病症状，这与细菌群落多样性的减少有关。
结论：低分子量化合物可以预测地引导根际微生物组的功能，为根据特定植物品种或作物制度的根渗出模式设计微生物组提供指导。
2 材料和方法
2.1 低分子量有机化合物的制备和组装
作者选择了48种低分子量有机化合物（12种糖、12种氨基酸、12种有机酸和12种酚酸，表S1）通常发现在番茄组织或根出。除了所有 48 种单化合物外，作者还使用 54 种独立的低分子量化合物组合（表 S2）组装了16种化合物混合物。每个组合由四种糖、四种氨基酸、四种有机酸和四种酚酸随机组成，48种碳资源中每个都包括18种不同的组合。每种化合物或化合物混合物均以20%（v：v） 甲醇中的1.3125克C/L的标准化溶液进行，这是用于若干研究的既定程序，在所有物质的溶解化和对土壤微生物群的影响最小之间产生妥协。每个溶液都调整到 pH 为 7.0，以防止酸度差异使微生物组组装中的结果偏置。这些化合物中没有一种具有电荷，而且大多是复杂和惰性碳化合物。因此，在制备化合物混合物溶液时，未观察到化学反应的迹象（如气体或降水产生或颜色变化）。由于甲醇也是一种碳源，并可能影响社区的组成，作者包括甲醇只治疗，以解释其效果。还包括水处理，以比较仅水处理和溶剂处理对土壤细菌社区成分的影响。
2.2 在土壤调节实验中筛选不同化合物的影响
作者采用了麒麟番茄田间（118°57ʹE，32°03ʹN）收集的表土（0~20厘米）进行实验，用不同低分子量化合物处理土壤，以评估其对微生物群组成和丰度的影响。该地块已经感染了细菌植物病原体青枯菌超过 15 年。土壤类型为Udic Argosol，pH 为 5.4，总碳为 19.7 克/千克，总氮为 6.3 克/千克，可用钾为 178 毫克/千克，可用磷为 172.9 毫克/千克，有机物含量为 24.6 克/千克。土壤过4 毫米筛子并完全均质化处理，然后分装到土盆（35 厘米 × 25 厘米 × 10 厘米），每个土盆含 600 克（干重）土壤进行实验。
使用以下实验设计对每种化合物或化合物混合物的效果进行了独立测试：用于对照（仅用甲醇处理）的4个平行，单一化合物（48种）和多种化合物（54种）的3个平行，表S2。每个平行由两个独立的技术重复土盆组成，以确保有足够的条件土壤进行第二次实验（土壤抑制）。由于番茄每日分泌碳没有被报道过，作者使用从玉米和燕麦在沙土中得出的估计值：每日每克分泌0.05~0.1毫克碳。这可能是一个保守的估计，与玉米、小麦和大麦相比，番茄根分泌的碳含量更大。为了模拟自然渗出，每周使用低分子量有机化合物混合物两次，每次84小时，共持续6周。在每次施用时，土盆补充 0.075 mg 碳/g 土壤/天的低分子量有机化合物（每盆 120 mL）。然后用无菌5毫升的枪头彻底混合土壤，以确保化合物均匀分布。土盆保持在温室内，自然温度变化范围为20 ~ 32℃，经过6周的调理后采集土壤样品进行DNA提取，进行细菌群落组成分析，方法如下。
2.2.1 土壤DNA提取
每盆取4个直径为1 cm × 10 cm深的土芯，将两盆土壤样品混合，分别进行3次和4次生物重复，分别进行碳处理和对照处理。使用MoBio PowerSoil DNA提取试剂盒，按照制造商的说明，使用0.5 g均质土芯亚样进行DNA提取。采用NanoDrop （ND2000, ThermoScientific）分光光度计测定DNA的数量和质量，等分DNA进行定量PCR（qPCR）分析和16S rRNA扩增子测序。
2.2.2 土壤样本中细菌丰度和病原体密度的定量
采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（Takara）和7500 Fast Real-Time PCR系统（Applied Biosystems）进行定量PCR检测R. solanacearum密度和细菌总生物量。使用特异性引物Rsol_fliC和通用引物Eub338/Eub518分别靶向R. solanacearum fliC基因和细菌16S rRNA基因的V4区。质粒标准载体（pmd19 - t）是从克隆的靶基因（fliC基因或16S rRNA基因）中产生的，使用的是青枯菌QL-Rs1115，这是最初收集土壤的田间的优势基因型。标准曲线是根据先前发表的方案生成的，每个样本检测3次。
2.2.3 确定土壤样本中的细菌菌体多样性和组成
使用16S rRNA扩增子测序来确定土壤样品中的细菌群落组成和多样性。每个单一化合物和16个混合化合物碳处理重复的3个DNA产物合并为一个。在碳类和组合水平（单碳和16碳处理N = 12和N = 54）比较了细菌群落多样性和组成的差异。利用563F和802R引物和优化PCR条件下扩增细菌16S rRNA基因的V4区域。PCR产物纯化，最终样品采用Illumina MiSeq上海测序公司（2x250PE, Biozeron biotechnology Co., Ltd）测序。序列读取使用UPARSE流程进行处理。简单地说，对每个样本的reads进行组装，去除低质量核苷酸（最大预期误差为0.25）、短读段（<200 bp）和单核苷酸。然后使用97%的相似性将序列聚类为操作分类单元（OTUs），并使用UCHIME去除嵌合序列。所有土壤样品获得了25,013到38,779（平均= 31,032）条高质量序列。然后使用Mothur分析代表性序列和OTU表，对所有样本进行重抽样（深度 = 25,013），并使用RDP 16S rRNA分类器进行分类学注释。
2.3 抑制细菌枯萎病的发病率
在另一个实验中，作者评估了土壤调节在抑制细菌性枯萎病方面如何影响微生物组功能。在土壤调节实验结束时，我们首先在半选择性培养基SMSA琼脂板上使用连续稀释涂布法对每个样品中的青枯菌密度进行了量化。然后，在土壤调节实验结束2天后，使用先前从同一块田地中分离的QL-Rs1115菌株进行过夜培养，并调整为5 × 10^6^ CFU/g土壤。将单菌落在NB培养基中培养过夜，离心8分钟后收集沉淀（10,000× g），并用无菌生理盐水（0.9% NaCl）洗涤2次。然后根据光密度（OD600）估计病原体密度，并通过NB培养基上的连续稀释计数试验进一步验证。50微升悬浮液（根据先前在SMSA介质上的稀释计数结果进行稀释）用于倒入土壤，孵育3天，以稳定接种的病原体，并通过连续稀释涂布来验证接种的病原体密度保持在一个数量级。接种番茄植株的准备方法如下：番茄种子用3% NaClO表面灭菌5分钟，在无菌蒸馏水中冲洗4次，在30°C黑暗中发芽2天。发芽后的种子在含有苗圃基质的育苗盆（6 cm × 6 cm × 6 cm）中播种。生长10天后（对应土壤调节试验结束后5天），将每株番茄幼苗轻轻洗净，4株移栽到含有600 g干重土壤调节试验均质土的大盆（35 cm × 25 cm × 10 cm）中。采用土壤调节试验的两个技术重复，以两个技术重复的8株苗为一个生物重复。4个重复用于对照（仅甲醇，N = 4），3个重复用于单一化合物（N = 144）和16种化合物混合物（N = 162），共获得2480株（620盆，每盆4株幼苗）。值得注意的是，在第二次试验中，土壤中没有添加低分子量化合物。与土壤调节试验相似，病害抑制试验在温室内进行，自然温度变化范围为25 ~ 35℃。在移植后40天记录青枯病的严重程度，以疾病指数0 - 4（0 =不萎蔫，1 = 1%-25%的叶片萎蔫，2 = 26%-50%的叶片萎蔫，3 = 51%-75%的叶片萎蔫，4 = 76%-100%的叶片萎蔫）进行评分。然后确定疾病发病率=[∑(给定疾病指数中患病植株数×给定疾病指数)×(总植株数×最高疾病指数)−1]× 100%。
2.4 统计分析
方差分析（ANOVA, Tukey’s HSD检验）和学生t检验采用SPSS(v. 19)比较处理间的平均差异。基于UniFrac距离（基于系统发育的距离度量）的主坐标分析（PCoA）对土壤微生物组组成进行排序和微生物组使用分子方差分析（AMOVA）进行比较。利用CANOCO对土壤细菌群落组成进行主成分分析（PCA）。在此分析中，最显著的前10%的OTU纳入PCA（基于线性判别分析，其中LDA使用Mothur评分为>3），并在分析前对输入数据进行log变换。使用DESeq2筛选与纯溶剂和纯水对照处理显著相关的OTU。利用R package lavaan包进行结构方程建模（SEM），比较植物源化合物对疾病发病率的直接和间接影响（通过土壤微生物组），并将影响可视化为简单的网络。SEM的第一步需要基于变量之间的理论因果关系建立初始模型。然后确定初始模型的拟合，并在拟合不佳的情况下进行调整。在本研究中，根据低分子量化合物类别与氮素添加比例、土壤细菌群落多样性和青枯病严重程度之间的关系生成初始SEM（图S2）。采用卡方检验（模型在低卡方值[~≤2]和高p值[传统的> 0.05]下拟合良好）和近似均方根误差（RMSEA;模型具有较低的RMSEA值[~≤0.05]和较高的p值[传统的> 0.05]的拟合效果）。观察到的细菌群落丰富度（Sobs指数）作为细菌群落多样性的输入数据。